一、淋巴細胞分離

分離使用Ficoll-Paque密度梯度分離淋巴細胞。將血液用磷酸鹽緩沖鹽水按 1:1 稀釋，并在 Ficoll-Paque 上分層，血液 + PBS: Ficoll 的比例保持為 4:3。血液在室溫下以 1800 rpm 離心 35 分鐘。去除淋巴細胞層（血沉棕黃層）并在 PBS 中以 1200 rpm 洗滌兩次，每次 10 分鐘，然后用培養(yǎng)基 RPMI 1640 洗滌。用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞密度。

二、培養(yǎng)條件

淋巴細胞在 15 ml 錐形聚苯乙烯離心管中的 5% CO2 加濕培養(yǎng)箱中于 37o 培養(yǎng)。通常，每個培養(yǎng)物由 2 毫升培養(yǎng)基中的 1x10 6 個細胞的初始密度組成。培養(yǎng)基由補充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨酰胺、100 單位/ml 青霉素、100 ug/ml 鏈霉素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 組成。

在起始后 44 小時將微核測定細胞松弛素 B 加入到培養(yǎng)物中。細胞松弛素 B 阻止細胞完成胞質(zhì)分裂，導致多核細胞的形成。細胞培養(yǎng)物中細胞松弛素 B 的最終濃度為 3 mg/ml。

在培養(yǎng)開始后 72 小時，使用細胞離心機 (Shandon, Sewickley, PA) 將淋巴細胞直接離心到載玻片上。然后將細胞以 600 rpm 的速度旋轉(zhuǎn)到載玻片上 10 分鐘。在室溫下甲醇固定 15 分鐘之前，讓載玻片風干。載玻片在-20℃ 下儲存在密封盒中，在 N2 下干燥。

三、細胞染色與微核測定

染色：將甲醇固定的載玻片在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分鐘。從載玻片中排出多余的液體，并用含有 0.2% Tween 20 的 PBS 1:1 稀釋 40-50 ul 抗動粒抗體應用% Tween 20。然后將載玻片蓋上蓋玻片并置于 37oC 的加濕室中 1 小時。在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中洗滌兩次，每次 5 分鐘后，再次排出多余的液體，用 1:50 稀釋的熒光山羊抗人 IgG覆蓋載玻片并再次孵育 1 H。因為熒光標記的抗體暴露在光線下會褪色，此步驟和所有后續(xù)步驟應在黃燈下進行。將載玻片在加 0.1% Tween 20 的緩沖液中沖洗兩次，并在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (2 ug/ml) 復染。

細胞微核

對于淋巴細胞微核測試，對 1000 個雙核淋巴細胞（那些經(jīng)歷了一次有絲分裂分裂的細胞）進行檢測，每個重復培養(yǎng)物中的 500 個細胞，用于計算微核的數(shù)量。通過切換到熒光濾光片來確定動粒點的存在與否。

檢測標準如下：

1) 細胞應具有完整的細胞質(zhì)的圓形或橢圓形外觀

2) 細胞核應同樣為圓形或橢圓形，具有完整的核膜

3) 只有經(jīng)歷過一次核分裂的細胞才應檢測微核的存在

4) 僅當微核大小為主核的三分之一或以下時才應計數(shù)

5) 微核的染色應與主核相似

6) 微核應與主核明顯分開。

細胞染色

復制指數(shù) (RI)，細胞分裂動力學的量度，通過計算每個樣本 400 個總細胞中含有 1、2、3 或更多細胞核的細胞百分比，從對微核進行檢測的相同載玻片上進行檢測。復制指數(shù)RI 計算如下：

RI = (1x% 單核細胞) + (2x% 雙核細胞) + (3x% tri) + (4x% 四核細胞）……

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