(一)實驗目的

通過細胞在細胞培養板上的克隆形成能力來提示細胞的增殖能力。

(二)實驗原理

克隆形成是測定細胞增殖能力的有效方法之一。單個細胞在體外持續6代以上，其后代所組成的細胞群稱為克隆。這時每個克隆含有50個以上的細胞，大小在0.3-1.0 mm之間，通過計數克隆形成率，可對單個細胞的增殖潛力做定量分析，了解細胞的增殖能力和獨立生存能力。

(三)實驗流程

(四) 實驗材料

生物安全柜、熒光顯微鏡、離心機、倒置顯微鏡、CO2培養箱；

完全培養基、胰酶、PBS、結晶紫、4%多聚甲醛。

(五)實驗步驟

1.  準備感染后細胞[如果是克隆形成預實驗，直接用空細胞進行實驗] ：將處于對數生長期的各實驗組細胞胰酶消化，完全培養基重懸，制成細胞懸液，計數。

吸棄培養基

PBS清洗

加入胰酶

終止消化

收集細胞

離心獲取沉淀

細胞計數

2.  細胞接種：于6孔板培養板中各實驗組接種500-1000個細胞/孔[正常增殖速度為1:5-1:10傳代，3天長滿細胞，可以接種500個細胞，其余增殖緩慢細胞，可以接種800-1000；接種時注意梯度稀釋細胞懸液，觀察細胞密度，以免因計數不準確導致實驗結果偏差] ，每個實驗組設3個復孔，培養基為含30%FBS的完全培養基；

鋪板

鋪板后搖勻

3.  將接種好的細胞搖勻后輕放于培養箱中繼續培養，每隔3 天進行換液并觀察細胞狀態，顯微鏡下觀察克隆大小[3復孔之間克隆大小應相似] ，待單個克隆生長到大小不超過圖片視野時可以進行拍照；

4.  拍完照之后的將6孔板放入培養箱中繼續培養，待孔中大多數單個克隆中細胞數大于50為止，棄上清，PBS洗滌細胞1次。

5.  每孔加入1 mL 4%多聚甲醛[有毒，注意在安全柜中操作] ，4度冰箱固定細胞60 min，PBS洗滌細胞1次。

加入多聚甲醛

6.  每孔加入潔凈、無雜質結晶紫染液1000 μL，染細胞2min。

7. ddH2O洗滌細胞數次，晾干，數碼相機拍照整，克隆計數。

吸棄染液

加入超純水清洗

晾干

拍攝

(六) 吉凱結果

1. 數碼照相機拍攝結果

2. 熒光顯微鏡拍攝代表性克隆結果

(七) 實驗操作參考文獻

[1] Ruan J. et al. Increased expression of cathepsin L: a novel independent prognostic marker of worse outcome in hepatocellular carcinoma patients. PLoS One. 2014, 9(11):112-136.

[2] Sun R. et al. Down regulation of Thrombospondin2 predicts poor prognosis in patients with gastric cancer. Mol Cancer. 2014, 13:225.

[3] Ma Y. et al. Prostate cancer cell lines under hypoxia exhibit greater stem-like properties. PLoS One. 2011, 6(12):e29170.

[4] Suresh B. et al. Stability and function of mammalian lethal giant larvae-1 oncoprotein are regulated by the scaffolding protein RanBPM. J Biol Chem. 2010, 285(46):35340-9.

[5] Liu JW. et al. ssDNA-binding protein 2 is frequently hypermethylated and suppresses cell growth in human prostate cancer. Clin Cancer Res. 2008, 14(12):3754-60.