骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞及其在脊髓損傷治療中的應(yīng)用

      每年全世界有數(shù)十萬(wàn)例的脊髓損傷發(fā)生，這給臨床醫(yī)生提出了很大的挑戰(zhàn)，但直到目前為止，尚沒(méi)有很好的治療方法。自從發(fā)明應(yīng)用類(lèi)固醇激素抗炎治療明顯改善癥狀以后，沒(méi)有新的療效明顯可靠的治療方法誕生。但是隨著近年來(lái)隨著對(duì)脊髓損傷機(jī)理的認(rèn)識(shí)的深化和相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)明，對(duì)脊髓損傷的治療手段有可能在不遠(yuǎn)的將來(lái)得到加強(qiáng)，這些給從事神經(jīng)科學(xué)研究的學(xué)者帶來(lái)了樂(lè)觀的氣氛 (1)。在這些方法中，細(xì)胞移植是一個(gè)主要的方向之一。

      目前研究用于移植的細(xì)胞有胚胎干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞、胎兒的神經(jīng)干細(xì)胞、成體神經(jīng)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞等。其中對(duì)胚胎和胎兒的神經(jīng)干細(xì)胞研究比較多，但是胚胎和胎兒的神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用面臨倫理學(xué)的問(wèn)題，其來(lái)源有限難以滿(mǎn)足臨床需要，不能隨時(shí)隨地取材；供體細(xì)胞有傳染疾病的可能，對(duì)供體要做嚴(yán)格的復(fù)雜的檢測(cè)；細(xì)胞在體外的擴(kuò)增較慢，而且需要用多種昂貴的生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)其增殖和分化；有免疫排斥反應(yīng)影響其功能的發(fā)揮。有鑒于此，近年來(lái)科學(xué)家對(duì)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化表示了極大的興趣。

      骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells）的發(fā)現(xiàn)至今有135年的歷史，在體外的分離培養(yǎng)有26年的歷史。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是成分混雜的一組細(xì)胞，由細(xì)胞形態(tài)和生化特征都明顯不同的細(xì)胞類(lèi)型組成：骨髓成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。骨髓基質(zhì)細(xì)胞中非造血前體細(xì)胞也稱(chēng)為間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC），BMSC和MSC的概念常被混用。近年來(lái)BMSCs日益成為研究的熱門(mén)對(duì)象，原因是不斷發(fā)現(xiàn)它有多種多樣的分化能力，不僅能分化出中胚層的骨、軟骨、肌肉、肌腱、脂肪、血管內(nèi)皮等(2)，而且還令人驚奇地可以跨胚層橫向分化（transdifferentiate）出內(nèi)胚層的肝細(xì)胞(3)、肺泡上皮細(xì)胞(4)和外胚層的神經(jīng)細(xì)胞。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的發(fā)現(xiàn)

      發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞能夠向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是一個(gè)偶然的過(guò)程。為了研究成體動(dòng)物的腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源是否可以來(lái)源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的造血系統(tǒng)，1997年Eglitis(5)將有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因標(biāo)記或者雄性小鼠的骨髓通過(guò)尾靜脈注射移植到雌性小鼠的體內(nèi)，用原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)3天后移植的骨髓細(xì)胞通過(guò)了血腦屏障出現(xiàn)在受體的腦中，并且數(shù)量不斷增加，廣泛分布于腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、腦干、小腦，表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志F4/80，并令人驚奇地的發(fā)現(xiàn)表達(dá)星型膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP(glial fibrillary acidic protein)。 移植4周后，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞占受體腦內(nèi)存活的供體細(xì)胞的0.5% 到2%。

      受此啟發(fā)，在接下來(lái)的幾年中，將骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植到腦組織中的研究成為一個(gè)熱點(diǎn)。Azizi (6)等將人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)，加入bis-benzamide中培養(yǎng)24小時(shí)標(biāo)記，通過(guò)鉆孔將10μl約100 000個(gè)細(xì)胞注射到大鼠腦中，分別在5、14、30、72天取材檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)72天后植入的細(xì)胞有約20 ％在大鼠腦中存活，并且沿著和植入的神經(jīng)干細(xì)胞相同的路徑遷移，廣泛分布于腦中，移植的細(xì)胞不再表達(dá)Ⅰ型膠原，fibronectin（纖維結(jié)合素）的表達(dá)也明顯降低。此項(xiàng)研究表明骨髓基質(zhì)細(xì)胞在腦中有較強(qiáng)的存活或者增殖能力，表型也隨移植的環(huán)境發(fā)生改變。

      Brazelton等(7)實(shí)驗(yàn)在生理?xiàng)l件下誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用表達(dá)GFP(green fluorescent protein，綠色熒光蛋白)的成年（8-10周）小鼠骨髓經(jīng)過(guò)尾靜脈注射到成年小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射6×106個(gè)有核細(xì)胞。2-12月后取材，發(fā)現(xiàn)GFP+細(xì)胞在腦中存活，20％以上不表達(dá)CD45和CD11b。GFP+細(xì)胞大部分（平均63.5％）表達(dá)F4/80（小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的表型），無(wú)細(xì)胞表達(dá)GFAP，小部分（平均36.5％）細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志NeuN（neuron-specific nuclear protein，神經(jīng)元特異性核蛋白）和NF-H（neurofilament- 200，神經(jīng)微絲-200）。8-12周后移植小鼠的腦中約0.2-0.3 ％的神經(jīng)元來(lái)源于移植的骨髓，并且骨髓來(lái)源的神經(jīng)元和周?chē)Ｉ窠?jīng)元一樣對(duì)周?chē)h(huán)境的變化產(chǎn)生反應(yīng)，使CREB（cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）磷酸化。

      Kopen等（8）將培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞用CD11b抗體標(biāo)記的磁珠分選出CD11b(－)細(xì)胞，把50 000個(gè)細(xì)胞/5μl注射到出生3天的新生小鼠的側(cè)腦室中，12天后發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞遍布前腦和小腦，對(duì)腦部組織結(jié)構(gòu)無(wú)破壞，在紋狀體和小腦中發(fā)現(xiàn)來(lái)源于供體骨髓基質(zhì)細(xì)胞的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，在腦干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)來(lái)源于供體骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)微絲陽(yáng)性細(xì)胞。骨髓基質(zhì)細(xì)胞在新生小鼠腦內(nèi)的變化和發(fā)育中的腦組織一致。Kopen認(rèn)為腦組織中分泌的FGF-2能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的受體NGFR（9）促進(jìn)其向神經(jīng)細(xì)胞分化。

      Mezey等（10）將50μl約1×107個(gè)雄性小鼠的骨髓細(xì)胞注射入出生24小時(shí)以?xún)?nèi)的雌性PU.1基因敲除的小鼠的腹腔中，其中含造血干細(xì)胞0.05到 0.5%，約0.125 %是基質(zhì)細(xì)胞。1－4月后檢測(cè)，腦內(nèi)有2.3-4.6 ％的細(xì)胞Y染色體陽(yáng)性，在腦中所有NeuN陽(yáng)性的細(xì)胞中，有0.3-2.3 ％是Y染色體陽(yáng)性，所有NeuN陽(yáng)性的細(xì)胞NSE(neuron-specific enolase，神經(jīng)元特異性烯醇化酶)染色也是陽(yáng)性的。許多Y染色體陽(yáng)性出現(xiàn)在側(cè)腦室的脈絡(luò)叢、室管膜和蛛網(wǎng)膜下腔中，表明腦脊液是這些細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的通道。

      Priller等（11）用激光共聚焦顯微鏡觀察活體腦組織在靜脈注射移植了GFP標(biāo)記的骨髓基質(zhì)細(xì)胞后的變化，1-6月時(shí)腦內(nèi)的GFP陽(yáng)性細(xì)胞較少，但移植15月后發(fā)現(xiàn)小腦中有GFP陽(yáng)性的成熟的浦肯野細(xì)胞（Purkinje cells ），表達(dá)γ氨基丁酸（GABA）合成酶，谷氨酸脫羧酶，表明細(xì)胞中有神經(jīng)遞質(zhì)的合成。

骨髓細(xì)胞間充質(zhì)干在體外誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞的研究
     

     為驗(yàn)證骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化的條件，研究者又在體外進(jìn)行了誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)。

     Woodbury等（12）在2000年報(bào)道了在體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)，神經(jīng)誘導(dǎo)液含抗氧化劑BME（β-mercaptoethanol，β-巰基乙醇）、DMSO（dimethylsulfoxide ，二甲亞砜）、BHA（butylated hydroxyanisole，丁羥茴醚）。在誘導(dǎo)液的作用下，部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)在60分鐘后發(fā)生變化，3小時(shí)后反應(yīng)細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征，扁平的胞體收縮，逐漸成球形，折光強(qiáng)，呈現(xiàn)  典型的核周體外形，同時(shí)細(xì)胞膜突起，形成初級(jí)和次級(jí)分支，以及生長(zhǎng)錐樣的末端膨大和可能的絲足突起。

    和細(xì)胞外形的改變同步的是BMSCs的表型的變化。作者檢測(cè)了多個(gè)指標(biāo)，包括Nestin（巢素蛋白，一種中間絲蛋白，表達(dá)于神經(jīng)上皮前體細(xì)胞，隨神經(jīng)細(xì)胞的成熟逐漸減少）、NSE、NF-M(一種神經(jīng)元特異性中間絲，有助于軸突的延伸)、tau(分化過(guò)程中的神經(jīng)元表達(dá)的神經(jīng)元特異性的微管蛋白)、trkA（高親和力的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的受體）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)后未反應(yīng)細(xì)胞有輕微的NSE染色，而反應(yīng)細(xì)胞的NSE表達(dá)不斷增強(qiáng)，絕大多數(shù)胞體變?yōu)閳A形有突起的細(xì)胞表達(dá)高水平的NF-M，部分反應(yīng)細(xì)胞只在突起中表達(dá)NF-M，顯示成熟神經(jīng)元的表型，神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體和突起中均有tau表達(dá)。所有的神經(jīng)元樣細(xì)胞都表達(dá)NSE，但是只有一部分表達(dá)NeuN，暗示這部分細(xì)胞是有絲分裂期后的成熟的神經(jīng)元。誘導(dǎo)5小時(shí)后，部分MSC來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞高水平表達(dá)Nestin，隨著誘導(dǎo)神經(jīng)的延長(zhǎng)，Nestin的表達(dá)逐漸減少，到第6天就檢測(cè)不到了，但trkA從5小時(shí)到6天的時(shí)間段中持續(xù)表達(dá)，這些表明了神經(jīng)細(xì)胞不斷成熟的過(guò)程。反應(yīng)細(xì)胞的GFAP染色為陰性，表明在體外誘導(dǎo)中，MSC不向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化。聯(lián)合應(yīng)用DMSO/BHA時(shí)誘導(dǎo)MSC成為神經(jīng)元的比例最高，有約80％的細(xì)胞表達(dá)NSE和NF-M。

    Mezey等（10）在體外檢測(cè)BMSCs 的神經(jīng)細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)急性分離的細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后Nestin染色陰性，加入含PDGF（platelet-derived growth factor）10 ng/ml的DMEM-10% FCS中培養(yǎng)15天后，18-50％的細(xì)胞為Nestin陽(yáng)性。

    Sanchez-Ramos等（13）發(fā)現(xiàn)BMSCs用含EGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)，表達(dá)Nestin的蛋白和mRNA，加入0.5mΜ RA(all-trans-retinoic acid,全反式視黃酸)、10ng/ml BDNF(brain-derived neurotrophic factor，腦源性神營(yíng)養(yǎng)因子)和10％ FCS的誘導(dǎo)液后，BMSCs中fibronectin陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，許多大而扁平的fibronectin陽(yáng)性細(xì)胞變?yōu)橛虚L(zhǎng)突起的針樣細(xì)胞或者小的卵圓形的細(xì)胞，其fibronectin陰性。NeuN陽(yáng)性和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的0.5 ％ 和1 ％。在BMSCs和神經(jīng)細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，2.5×105個(gè)大鼠BMSCs種在2.5×105大鼠中腦細(xì)胞上，使用含RA和BDNF的N5培養(yǎng)基，2周后固定染色，約2-5％ BMSCs的NeuN陽(yáng)性。人BMSCs和大鼠中腦細(xì)胞共培養(yǎng)1周后，2-4％ BMSCs的NeuN陽(yáng)性，聚集在大鼠中腦細(xì)胞周?chē)蕶E圓形或者針形，但沒(méi)有表達(dá)MAP-2（microtubule-associated protein-2），5-8％ BMSCs的GFAP陽(yáng)性。共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞之間的相互接觸和營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞的分化有重要作用。NeuN最開(kāi)始出現(xiàn)在神經(jīng)干細(xì)胞脫離細(xì)胞增殖周期開(kāi)始向神經(jīng)元分化的時(shí)候，而MAP2的表達(dá)在發(fā)育過(guò)程中晚于NeuN, 在新生大鼠一般多出現(xiàn)在出生后10-20天。BMSCs源的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)NeuN而不表達(dá)MAP2說(shuō)明細(xì)胞處于不成熟神經(jīng)元的階段，其向成熟神經(jīng)元的分化需要進(jìn)一步的長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)觀察。

     Deng等（14）發(fā)現(xiàn)未分化的hMSCs表達(dá)某些神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志，如MAP1B，TuJ1 (neuron-specific tubulin)，NSE，Vimentin（波形蛋白）。用0.5mM IBMX (isobutylmethylxanthine)/ 1mM dbcAMP (dibutyryl cylic AMP)誘導(dǎo)hMSCs，2天后出現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣外形，6天后占細(xì)胞總數(shù)的25 ％，而且有生長(zhǎng)錐樣末端結(jié)構(gòu)和未分化細(xì)胞接觸，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，但未死亡。細(xì)胞表達(dá)NSE和Vimentin升高，但MAP1B和TuJ1沒(méi)有變化，在未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)NF-M、MAP2、tau、GFAP、S-100（成熟星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志）、MBP(myelin basic protein，少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志)的表達(dá)，說(shuō)明hMSCs誘導(dǎo)成為早期的神經(jīng)前體細(xì)胞。從誘導(dǎo)6天的hMSCs中撤去IBMX/dbcAMP后培養(yǎng)，所有神經(jīng)元樣細(xì)胞死亡，說(shuō)明hMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化是不可逆的。IBMX是磷酸二酯酶抑制劑，dbcAMP是cAMP的類(lèi)似物，二者都可以提高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平，誘導(dǎo)hMSCs成為神經(jīng)前體細(xì)胞。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的研究

      發(fā)現(xiàn)MSCs能誘導(dǎo)成為神經(jīng)細(xì)胞后，研究者就開(kāi)始嘗試用MSCs移植治療脊髓損傷。

      Chopp等（15）將4μl 含2.5×105 MSCs 5分鐘注射到脊髓損傷中心處，對(duì)照組用PBS注射。一、二、四周后脊髓內(nèi)存活的MSCs分別是約為2.6×104、2.1×104和1.5×104個(gè)，在脊髓內(nèi)遷移的范圍分別距離注射中心2mm、＞2mm和5mm。用BBB (Basso-Beattie-Bresnehan)評(píng)分法分析脊髓功能恢復(fù)情況，術(shù)前為21分，脊髓挫傷后為0-6分，注射后為6.7-7.0分。對(duì)照組在注射4周后恢復(fù)到11.5分，到第3周后即為平臺(tái)期，恢復(fù)緩慢，運(yùn)動(dòng)功能明顯受限。注射MSCs組4周后恢復(fù)到15.3分，而且一直呈好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，到4周時(shí)未出現(xiàn)平臺(tái)期，大鼠四肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)，可支撐身體重量。免疫組化發(fā)現(xiàn)脊髓室管膜細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和脈管系統(tǒng)表達(dá)Nestin增加，注射MSCs的脊髓內(nèi)Rip(少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志)變?yōu)殛?yáng)性，植入的MSCs表達(dá)NeuN。作者認(rèn)為，MSCs植入促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)可能的作用機(jī)理為，受損的組織為移植的MSCs提供了微環(huán)境，產(chǎn)生信號(hào)誘導(dǎo)植入細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子，促進(jìn)室管膜細(xì)胞等的增殖，激活內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制。

      Hofstetter等（16）發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的MSCs有37.5% ± 1.2的Nestin陽(yáng)性。將MSCs用 5 mM 2-mercaptoethanol（β-巰基乙醇）誘導(dǎo)48小時(shí)，進(jìn)行膜片鉗檢測(cè)其電生理特性，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有表達(dá)鈉、鉀電壓門(mén)控通道，不產(chǎn)生動(dòng)作電位，說(shuō)明誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞是不成熟的神經(jīng)元。在T9脊髓挫傷處注射未經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的MSCs，分為損傷后立即植入組和延遲一周植入組，植入的細(xì)胞數(shù)為30 000/10μl。5周后，立即植入組的功能恢復(fù)和陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異，但是延遲植入組明顯促進(jìn)功能恢復(fù)，BBB評(píng)分由7.9提高到9.2。對(duì)照組動(dòng)物不能用后肢支撐體重，而延遲植入組的12只大鼠中有7只可以支撐體重，其中有2只恢復(fù)行走，前后肢協(xié)調(diào)，BBB評(píng)分為13分。5周后脊髓內(nèi)的MSCs來(lái)源的細(xì)胞數(shù)延遲植入組有2,966個(gè)，而立即植入組只有518 ± 106個(gè)。移植前后MSCs的表型發(fā)生變化：Vimentin ++/－，Laminin +/－，Nestin ++/－， NeuN －/+。植入的MSCs形成束狀縱向橋接病變區(qū)兩端的組織，有較多的星型膠質(zhì)細(xì)胞在其周?chē)L(zhǎng)，排列規(guī)律。沿MSCs束發(fā)現(xiàn)5-羥色胺陽(yáng)性的神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)纖維的出現(xiàn)應(yīng)該是改善損傷的脊髓功能的一個(gè)重要因素。

      總之，雖然目前誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)理不清，不同研究者的誘導(dǎo)和觀測(cè)方法不盡相同，結(jié)果不盡一致，但仍有充足的證據(jù)表明MSCs可以向神經(jīng)細(xì)胞分化，這可以為用細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供方便的取之不盡的細(xì)胞來(lái)源，具有很大的臨床應(yīng)用前景。

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