細胞死亡的方式主要有兩種，包括細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（apoptosis）。細胞壞死是早已被認識到的細胞死亡方式，而細胞凋亡是近年來逐漸被認識且越來越受到重視的細胞死亡方式。兩種死亡方式最重要的區別是細胞壞死會釋放出細胞內溶物，引起炎癥反應，而細胞凋亡不會暴露細胞內溶物，一般被吞噬細胞吞噬清除，不引起炎癥反應。

細胞凋亡，也稱細胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理條件下，細胞主動的、高度有序的、自己結束其生命的過程。細胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現象，胚胎形成、個體發育、衰老和損傷細胞的清除等都與細胞凋亡密切相關。細胞凋亡在免疫學中也非常重要，如T細胞在胸腺內發育的過程，經過陰性選擇和陽性選擇后，95%的胸腺細胞發生凋亡，只有5%的胸腺細胞發育為成熟T細胞進入外周。

檢測細胞凋亡的方法很多，如電子顯微鏡或者光學顯微鏡下的形態學觀察、細胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實驗等。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法，不僅可以定性，也可以定量。流式細胞術檢測細胞凋亡的方法也有很多，其中最重要是annexinV/PI雙染色法。其他的還有SYTO/PI雙染色法、細胞DNA含量分析法、線粒體損傷檢測法、活化的caspase-3檢測法、FLICA標記法、甲酰胺誘導ssDNA單抗檢測法、TUNEL法等。今天主要介紹一下annexinV/PI雙染色法。

Annexin V/PI雙染色法

正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS）位于細胞膜的內表面，細胞凋亡時，細胞膜發生變化，PS從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面。annexinV是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結合蛋白，annexinV可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS，而活細胞的PS位于細胞膜的內表面，無法與annexinV特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexinV鑒別凋亡細胞和活細胞。

壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，annexinV也能識別壞死細胞表面的PS，所以annexinV無法區分壞死細胞和凋亡細胞。而PI染料能夠與細胞內的DNA結合，區分壞死細胞和活細胞。凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發后會發射紅熒光，被FL2或FL3通道接收。所以annexinV和PI同時使用，就可以區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，這就是annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡的原理。

標記方法與常規標記熒光抗體的方能一樣：加入適量的FITC-annexinV和PI，4℃靜置30min即可。注意標記PI的方法與PI染色檢測細胞內DNA含量的方法不同，不需提前固定細胞，因為本方法標記PI是為了檢測細胞膜的通透性從而鑒別細胞是活細胞還是死細胞，而用PI檢測DNA含量時必須先破壞活細胞的細胞膜的完整性使PI進入細胞內與DNA結合。

下圖是用annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡得到的一張散點圖。圖中大致可以分為三大細胞群：右上象限的細胞表型為annexinV+PI+，代表的是壞死細胞；右下象限的細胞表型為annexinV＋PI-，代表的是凋亡細胞；左下象限的細胞表型為annexinV-PI-，代表的是活細胞。通過annexin V/PI雙染色法可以非常明確地區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并且可以定量分析各自所占的比例。

例：

下圖引自［1］，作者用annexinV/PI雙染色法檢測人肺癌細胞系“H1299”和“A549”細胞凋亡，證明人肺癌細胞表面的TLR4受體與LPS結合后，能夠增強其抵抗TNFα和TRAIL誘導的凋亡。

從圖中可以看出，TRAIL誘導后，H1299人肺癌細胞系的凋亡比例從3.36%上升到13.7%，被TNF-α/CHX誘導后，凋亡比例上升到16.9%；如果在誘導前加入LPS，活化H1299表面TLR4信號，被TRAIL誘導后凋亡比例只有3.8%，被TNF-α/CHX誘導后凋亡比例只有3.93%,說明H1299表面TLR4信號的活化能夠促進其抵抗凋亡。另一個人肺癌細胞系A549的結果也相似，LPS活化TLR4信號后，TRAIL誘導凋亡比例從16%下降到3.09%，而TNF-α/CHX誘導凋亡比例從17%下降到11.8%。

［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.

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