小鼠調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(Treg)鑒定步驟

配色方案

小鼠Treg鑒定所需流式抗體

小鼠Treg鑒定所需輔助試劑

樣本管設(shè)置

實驗步驟

一、小鼠脾細(xì)胞分離步驟：

1.取小鼠脾臟，置于PBS中；

2.可用注射器柱塞研磨脾臟，并通過70μm細(xì)胞過濾器過濾，收集濾液到15mL離心管；

3.300g離心5min，棄上清，得到紅色細(xì)胞沉淀；

4.加2mL 1x紅細(xì)胞裂解液，重懸沉淀，室溫下裂解2~3min，再加10mL PBS，終止裂解反應(yīng)；

5.300g離心5min，棄上清，得到白色細(xì)胞沉淀，用細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，并做細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。

二、細(xì)胞固定破膜實驗步驟：

（下面是全染管的實驗步驟，空白組不加抗體，單染管只在對應(yīng)步驟加對應(yīng)流式抗體，同型對照組將相應(yīng)的流式抗體替換成同型對照，所有組都要固定破膜）

1.根據(jù)檢測的量，稀釋Foxp3檢測專用的固定劑和破膜劑；

2.取100μL小鼠脾臟細(xì)胞（1×106個細(xì)胞），置于流式管內(nèi)，加入1Test的FITC Anti-Mouse CD4（E-AB-F1097C）和1Test的APC Anti-Mouse CD25（E-AB-F1102E）混勻，4℃孵育30min；

3.孵育完畢后，加入1mL細(xì)胞染色緩沖液，300g離心5min，棄上清，再加入100μL細(xì)胞染色緩沖液，重懸細(xì)胞；

4.加入1mL固定劑，渦旋混勻，4℃反應(yīng)30min；反應(yīng)完成后，600g離心5min，棄上清；

5.加入2mL破膜劑，渦旋混勻，600g離心5min，棄上清；

6.重復(fù)步驟5；

7.加入100μL破膜劑，重懸細(xì)胞，再加入PE Anti-Mouse Foxp3（E-AB-F1238D），混勻后室溫孵育30min；

8.加入2mL破膜劑，600g離心5min，棄上清；

9.加入200μL細(xì)胞染色緩沖液，重懸細(xì)胞，即可上機檢測。

解析：

? 圈門路徑：

首先，根據(jù)FSC-A和SSC-A圈中目的細(xì)胞；

其次，利用光散射特性，去黏連，得到單細(xì)胞；

再次，通過CD4，確定CD4+輔助T細(xì)胞；

最后，通過CD25+/Foxp3+，確定出Treg細(xì)胞亞群。

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