細胞凍存和復蘇技術是細胞培養過程中較為基礎的實驗操作，此舉對于細胞的保種以及細胞活力的維持有著重要意義，下面就細胞凍存及復蘇過程中的一些理論及實踐拿來與大家分享。

      細胞凍存和復蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會導致細胞內冰晶的產生，從而使細胞產生內源性的機械損傷，引起細胞內環境滲透壓，PH，電解質等的改變，進而促使細胞死亡。常用的凍存保護劑為二甲基亞砜（DMSO）和甘油，凍存細胞時加入保護劑，一方面可以提高細胞膜對水的通透性，另一方面使冰點降低，延緩凍結過程。緩慢凍存細胞的過程中，加入保護劑可以使細胞內水分滲出到細胞外，一定程度上減少胞內冰晶的產生，而在快速復蘇細胞的過程中，能使胞外冰晶迅速融化，防止水分滲入胞內再次形成冰晶而損傷細胞。

      目前來講，大多數細胞凍存時均采用DMSO作為保護劑，部分細胞因對DMSO毒性敏感，可以選用甘油作為凍存保護劑。另有CEM及K562細胞實驗表明加入保護劑的細胞存活率明顯高于不加保護劑的，而采用甘油保護劑組的細胞較DMSO組細胞也呈現較高的存活率。

細胞凍存的常規程序為：

1、配置含10%-15%（常見為10%）的DMSO或甘油，含10%-20%血清的凍存培養液；

      一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞。有人親測10%血清凍存細胞，結果證明是可以的，但高血清比例的凍存液更有助于提高細胞活力，此外嬌貴的細胞可以適當提高凍存液中血清的比例以保證獲得更高的存活率及活力。我們用的凍存液配方含10%的DMSO，40%的血清及50%的完全培養基，復蘇細胞后細胞狀態良好。

2、取增殖期細胞胰酶消化下轉移至離心管，離心富集細胞，懸浮細胞則直接轉移至離心管離心富集即可；

      細胞最好處于對數生長期，而匯合度最少到50%以上，其他狀態的細胞也可凍存，但是復蘇時存活率會大大降低。

3、用配好的凍存液重懸細胞，并調節細胞密度至5×106/ml-1×107，轉移至凍存管中；

      具體凍存密度因細胞不同而異，高密度或者低密度對細胞成活率都有一定的影響。此階段細胞最好放于冰上或4℃，盡量減少細胞的常溫代謝活動。

4、細胞凍存：常見的方法主要有兩大類，一類為傳統方法，另一類為程序降溫；

4.1、傳統方法：凍存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小時（或過夜）→ 轉移至液氮長期儲存。

      細胞置于4℃及-20℃的時間不必太長，且從4℃轉移至-20℃時，最好顛倒混勻下細胞，防止細胞大量沉降堆積至管底，影響細胞復蘇。

4.2、程序降溫：將細胞轉移至細胞漸凍盒后放于-80℃冰箱過夜或置于漸凍儀中以1-2℃/min的降溫速率將至-100℃后，再將細胞轉移至液氮長期保存；

      此過程的核心就是：緩降。因此，有人在凍存管外面包裹一團拳頭大小的棉花，將細胞轉移至-80℃冰箱過夜后，次日直接轉移到液氮，這種簡易的做法也是可行的。還有將-80℃冰箱過夜后，又增加了一步將細胞懸掛于液氮液面上一段時間，再轉移至液氮，這種做法也可以一定程度上提高細胞的存活率。

細胞復蘇的常規程序為：

1、 快速解凍，液氮中取出凍存細胞后，迅速放入37℃水浴中，輕輕搖動細胞，待其全部融化；

      為使凍存管快速解凍，此過程中水浴溫度可以也調整至40℃，邊晃動邊觀察，待凍存管中殘留有小塊冰時，停止即可，此時凍存管中細胞仍維持在0℃左右，甚至有經驗豐富的大神直接用將近60℃的水浴復蘇細胞，復蘇后細胞狀態也挺好。細胞復蘇要迅速，一般要求在1min左右，而且為減少DMSO的細胞毒性，盡量保證在3min以內完成細胞解凍。

2、 解凍后的細胞可直接接種到含完全培養基的細胞培養瓶中直接進行培養，24小時后再更換新鮮完全培養液，以去除舊培養液中的DMSO。

      為進一步減少DMSO的細胞毒性，待細胞解凍后可以將細胞緩慢加至含培養基于離心管中，此舉一方面可以稀釋DMSO的濃度，另一方面也可以使細胞緩慢適應培養基的生長環境，離心棄上清，重懸細胞后再將細胞接種至培養瓶中，次日換液。需要注意的是很多人認為是次日換液這一步既浪費培養基又費時費力，沒有這種必要，曾經一位細胞庫的專家在談到細胞復蘇時則專門強調這件似乎“無足輕重”的舉措，故這一操作對于細胞復蘇的重要性可見一斑。